Tudo sobre análises por Cromatografia

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que também poderiam ser considerados precursores do uso dessa técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas.

O que é Cromatografia?

É um método físico-químico de separação e identificação de componentes de uma mistura. Essa técnica é baseada na migração dos compostos da mistura, os quais apresentam diferentes interações através de duas fases.

Fase móvel: fase em que os componentes a serem isolados ‘percorrem’ por um solvente fluido, que pode ser líquido ou gasoso.

Fase estacionária: fase fixa em que o componente que está sendo separado ou identificado irá se fixar na superfície de outro material líquido ou sólido. O processo cromatográfico consiste na passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, dentro de uma coluna ou sobre uma placa. Assim, os componentes da mistura são separados pela diferença de afinidade através das duas fases. Cada um dos componentes da mistura é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.

Tipos de Cromatografia

Podem ser classificados de acordo com a forma física do sistema cromatográfico, pela fase móvel empregada, pela fase estacionária utilizada e pelo modo de separação.

Cromatografia em coluna

É uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida associada, sendo que os mais utilizados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó. Esse tipo de cromatografia é comumente utilizado para purificação de substâncias orgânicas ou, para remover o material de partida ou isolar o produto desejado de uma reação.

Cromatografia planar

Este tipo de cromatografia utiliza uma superfície plana e compreende a cromatografia em papel.

Cromatografia em papel

É uma técnica para líquido-líquido, no qual um deles é fixo a um suporte sólido. Recebe esse nome porque a separação e identificação dos componentes da mistura ocorre sobre a superfície de um papel filtro, sendo essa a fase estacionária.

Cromatografia em camada delgada (CCD)

É uma técnica do tipo líquido-sólido, onde a fase móvel líquida percorre uma fase estacionária sólida adsorvida sobre um suporte, que este pode ser uma placa de vidro ou metálica, na qual é fixada um material adsorvente, como alumina (Al2O3) ou sílica (SiO2), que serão a fase estacionária.

 Cromatografia gasosa

É um processo de separação dos componentes da mistura através da passagem de uma fase móvel gasosa por uma fase estacionária sólida. Essa técnica é do tipo coluna, onde o gás de arraste (fase móvel) passa por um longo tubo estreito com material adsorvente sólido fixado
em seu interior (fase estacionária). Os fatores que promovem a separação dos componentes são: a estrutura química do
composto, a fase estacionária e a temperatura da coluna.

Vantagens: Alto poder de resolução (análise de muitos componentes de uma única amostra), sensibilidade, pequenas quantidades de amostra, análise quantitativa.

Desvantagens: Substâncias voláteis e estáveis termicamente, requer preparo da amostra (interferências e contaminações), tempo e custo elevado, eficiência qualitativa limitada

Cromatografia líquida

Na cromatografia líquida, a fase estacionária é constituída de partículas sólidas organizadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel.

Cromatografia líquida clássica:

A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A coluna de vidro é preenchida com material sólido adsorvente (fase estacionária), sendo completada com a fase móvel e em seguida adiciona-se a mistura da qual deseja-se realizar a separação e identificação dos componentes. Adiciona-se sucessivamente mais fase móvel até a completa separação de todos os componentes. O processo é lento e necessita de grandes volumes do solvente utilizado na fase móvel.

Cromatografia líquida de alta eficiência

Utiliza-se de colunas metálicas e bombas de alta pressão para a eluição (processo de passagem de um líquido ou de um gás por uma coluna cromatográfica) da fase móvel. Isso faz com que a fase móvel migre com uma velocidade razoável através da coluna, permitindo a realização da análise de várias amostras em pouco tempo.

Desvantagem: necessidade de equipamentos específicos, que devido a sua tecnologia e capacidade de detecção possuem preços elevados de custo e manutenção.

Cromatografia supercrítica

Este tipo de cromatografia caracteriza-se por utilizar como fase móvel um fluído supercrítico, ou seja, acima da sua temperatura crítica. O eluente supercrítico mais comumente utilizado é o dióxido de carbono (CO2).

Fase estacionária líquida

O líquido é adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele.
Vantagens: líquido pouco volátil, termicamente estável, quimicamente inerte.

Fase estacionária sólida

A fase estacionária é constituída de material sólido que pode ser empacotado ou adsorvido nas paredes de uma coluna ou fixado em um suporte sólido.

Modo de separação

Adsorção

Na cromatografia de adsorção as separações ocorrem através de interações eletrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás). A natureza da fase estacionária pode ser muito diversa, nomeadamente sílica gel, alumina ou celulose.

Partição

A cromatografia de partição é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido).

Troca iônica

Na cromatografia de troca iónica a separação ocorre devido às diferentes tendências dos componentes iônicos ou ionizáveis permutarem com íons da fase estacionária, que, assim, são deslocados para a fase móvel. A afinidade entre os íons da fase móvel e o suporte pode ser controlada por alteração do pH e da força iônica do eluente.

Afinidade

Na cromatografia de afinidade ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária. Esta técnica utiliza-se especificamente para separar produtos biológicos, e como exemplos podemos citar: ligações enzimas e substratos, anticorpos e substratos e receptores.

Exclusão molecular

A cromatografia de exclusão molecular, separa os componentes segundo o tamanho efetivo (raio hidrodinâmico) das moléculas, isto é, moléculas grandes não penetram no interior do suporte (partículas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as moléculas pequenas vêm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais
tardiamente.

O que é Cromatografia?

É um método físico-químico de separação e identificação de componentes de uma mistura. Essa técnica é baseada na migração dos compostos da mistura, os quais apresentam diferentes interações através de duas fases.

Fase móvel: fase em que os componentes a serem isolados ‘percorrem’ por um solvente fluido, que pode ser líquido ou gasoso.

Fase estacionária: fase fixa em que o componente que está sendo separado ou identificado irá se fixar na superfície de outro material líquido ou sólido.
O processo cromatográfico consiste na passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, dentro de uma coluna ou sobre uma placa. Ou seja, os componentes da mistura são separados pela diferença de afinidade através das duas fases.
Cada um dos componentes da mistura é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes. Desta forma, para entendermos melhor esse processo, é preciso primeiramente sabermos diferenciar absorção de adsorção, a seguir:

Absorção e Adsorção

Absorver: ato de passar uma substância para o interior da outra.
Adsorver: ligar uma substância a uma superfície. A superfície adsorve a substância.
Exemplo: Uma esponja absorve a água, já na adsorção, a substância fica apenas retida na superfície adsorvente, sem ser incorporada ao volume da outra. Aplicações da Cromatografia:

• Identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes;
• Purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis;
• Separação dos componentes de uma mistura;
• Em análises qualitativas e quantitativas.

Tipos de Cromatografia

As cromatografias podem ser classificados de acordo com a forma física do sistema cromatográfico, pela fase móvel empregada, pela fase estacionária utilizada e pelo modo de separação.

Cromatografia em coluna

É uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida associada, sendo que os mais utilizados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó. Esse tipo de cromatografia é comumente utilizado para purificação de substâncias orgânicas ou, para remover o material de partida ou isolar o produto desejado de uma reação.

Cromatografia planar

Este tipo de cromatografia utiliza uma superfície plana e compreende a cromatografia em papel.

Cromatografia em papel

É uma técnica para líquido-líquido, no qual um deles é fixo a um suporte sólido. Recebe esse nome porque a separação e identificação dos componentes da mistura ocorre sobre a superfície de um papel filtro, sendo essa a fase estacionária.

Cromatografia em camada delgada (CCD)

É uma técnica do tipo líquido-sólido, nisso a fase móvel líquida percorre uma fase estacionária sólida adsorvida sobre um suporte, que este pode ser uma placa de vidro ou metálica, na qual é fixada um material adsorvente, como alumina (Al2O3) ou sílica (SiO2), que serão a fase estacionária.

Cromatografia gasosa

É um processo de separação dos componentes da mistura através da passagem de uma fase móvel gasosa por uma fase estacionária sólida. Essa técnica é do tipo coluna, onde o gás de arraste (fase móvel) passa por um longo tubo estreito com material adsorvente sólido fixado em seu interior (fase estacionária). Os fatores que promovem a separação dos componentes são: a estrutura química do composto, a fase estacionária e a temperatura da coluna.

Vantagens: Alto poder de resolução (análise de muitos componentes de uma única amostra), sensibilidade, pequenas quantidades de amostra, análise quantitativa.

Desvantagens: Substâncias voláteis e estáveis termicamente, requer preparo da amostra (interferências e contaminações), tempo e custo elevado, eficiência qualitativa limitada

Cromatografia líquida

Na cromatografia líquida, a fase estacionária é constituída de partículas sólidas organizadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel.

Cromatografia líquida clássica

A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A coluna de vidro é preenchida com material sólido adsorvente (fase estacionária), sendo completada com a fase móvel e em seguida adiciona-se a mistura da qual deseja-se realizar a separação e identificação dos componentes. Adiciona-se sucessivamente mais fase móvel até a completa separação de todos os componentes. O processo é lento e necessita de grandes volumes do solvente utilizado na fase móvel.

Cromatografia líquida de alta eficiência

Utiliza-se de colunas metálicas e bombas de alta pressão para a eluição (processo de passagem de um líquido ou de um gás por uma coluna cromatográfica) da fase móvel. Isso faz com que a fase móvel migre com uma velocidade razoável através da coluna, permitindo a realização da análise de várias amostras em pouco tempo.

Desvantagem: necessidade de equipamentos específicos, que devido a sua tecnologia e capacidade de detecção possuem preços elevados de custo e manutenção.

Cromatografia supercrítica

Este tipo de cromatografia caracteriza-se por utilizar como fase móvel um fluído supercrítico, ou seja, acima da sua temperatura crítica. O eluente supercrítico mais comumente utilizado é o dióxido de carbono (CO2).

Fase estacionária líquida

O líquido é adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele.

Vantagens: líquido pouco volátil, termicamente estável, quimicamente inerte.

Fase estacionária sólida:

A fase estacionária é constituída de material sólido que pode ser empacotado ou adsorvido nas paredes de uma coluna ou fixado em um suporte sólido.

Modo de separação

Adsorção

Na cromatografia de adsorção as separações ocorrem através de interações eletrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás). A natureza da fase estacionária pode ser muito diversa, nomeadamente sílica gel, alumina ou celulose.

Partição

A cromatografia de partição é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido).

Troca iônica

Na cromatografia de troca iónica a separação ocorre devido às diferentes tendências dos componentes iônicos ou ionizáveis permutarem com íons da fase estacionária, que, assim, são deslocados para a fase móvel. A afinidade entre os íons da fase móvel e o suporte pode ser controlada por alteração do pH e da força iônica do eluente.

Afinidade

Na cromatografia de afinidade ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária. Esta técnica utiliza-se especificamente para separar produtos biológicos, e como exemplos podemos citar: ligações enzimas e substratos, anticorpos e substratos e receptores.

Exclusão molecular

A cromatografia de exclusão molecular, separa os componentes segundo o tamanho efetivo (raio hidrodinâmico) das moléculas, isto é, moléculas grandes não penetram no interior do suporte (partículas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as moléculas pequenas vêm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais tardiamente.

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